Plasmide CRISPR d'Activation (m) CAPS-1: sc-424190-ACT

Cadps code pour CAPS-1, une protéine activatrice dépendante du Ca2+ qui favorise l’amorçage des vésicules à cœur dense et régule l’exocytose régulée dans les cellules neuroendocrines et neuronales. En coordonnant l’état de préparation des vésicules et en couplant la signalisation Ca2+ à la sécrétion, CAPS-1 soutient la libération de neurotransmetteurs et de neuropeptides, la sécrétion hormonale et la fonction synaptique. L’activité de CAPS-1 recoupe les mécanismes de fusion membranaire médiée par les SNARE ainsi que les processus de cycle des vésicules présynaptiques qui modèlent l’excitabilité et la communication au sein des réseaux neuronaux. Une dérégulation du contrôle de la voie sécrétoire est pertinente pour les mécanismes étudiés dans des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, ainsi que dans des défauts de sécrétion endocrine, faisant de Cadps chez la souris un modèle utile de dysfonction cellulaire liée à la sécrétion.

CAPS-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cadps sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CAPS-1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cadps dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cadps, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CAPS-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cadps natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CAPS-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CAPS-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cadps silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.