Plasmide CRISPR d'Activation (m) calsequestrin 2: sc-419472-ACT

Le gène murin Casq2 code la calséquestrine 2, une protéine luminale du réticulum sarcoplasmique à forte capacité de liaison au Ca2+, qui tamponne et organise les réserves de Ca2+ afin de soutenir le couplage excitation–contraction. En modulant le comportement du canal du récepteur à la ryanodine (RYR2) et la cinétique de la libération de Ca2+ induite par le Ca2+, CASQ2 influence le cycle du Ca2+, la période réfractaire du réticulum sarcoplasmique et la stabilité contractile des myocytes. Une perturbation de l’homéostasie du Ca2+ dépendante de CASQ2 est associée à des mécanismes arythmogènes déclenchés par le stress et à des programmes de signalisation intracellulaire du Ca2+ altérés, faisant de Casq2 un nœud clé de la recherche en électrophysiologie cardiaque et en gestion du calcium. Dans les systèmes modèles, la modulation de Casq2 est couramment utilisée pour étudier le tamponnement du Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique, la dynamique des étincelles calciques (« Ca2+ sparks ») et les réponses de signalisation en aval à une perturbation des flux de Ca2+.

calsequestrin 2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Casq2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

calsequestrin 2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Casq2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Casq2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de calsequestrin 2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Casq2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de calsequestrin 2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie calsequestrin 2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Casq2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.