Plasmide CRISPR d'Activation (h) CA IX: sc-400905-ACT

Le gène humain CA9 code l’anhydrase carbonique IX (CA IX), une enzyme membranaire inductible par l’hypoxie qui catalyse l’hydratation réversible du CO₂ afin de réguler l’acidification extracellulaire et l’homéostasie du pH intracellulaire. CA IX soutient l’adaptation cellulaire au stress lié à un faible taux d’oxygène et interagit avec la signalisation HIF-1, les réseaux de transport ionique et la reprogrammation métabolique, qui influencent la survie cellulaire, la migration et la capacité de tamponnement du microenvironnement. Une expression dérégulée de CA9 est fréquemment étudiée comme marqueur de niches hypoxiques et acidifiées, et elle est associée à un équilibre rédox altéré ainsi qu’à des phénotypes liés à l’invasion dans des modèles de maladies des tissus solides. Ces propriétés font de CA IX un nœud utile pour étudier la signalisation dépendante du pH, les programmes transcriptionnels sensibles à l’hypoxie et les pressions de sélection induites par le microenvironnement.

CA IX Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CA9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CA IX Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CA9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CA9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CA IX. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CA9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CA IX au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CA IX dans les cellules tumorales présentant une expression de CA9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.