Plasmide CRISPR d'Activation (h) CA IV: sc-404215-ACT

Le gène humain **CA4** code l’anhydrase carbonique IV (CA IV), une métallœnzyme extracellulaire ancrée au glycosylphosphatidylinositol (GPI) qui catalyse l’hydratation réversible du CO₂ en bicarbonate et en protons. En accélérant l’interconversion CO₂/HCO₃⁻ à la surface cellulaire, la CA IV contribue à l’homéostasie acido-basique, au transport ionique épithélial et à la prise en charge du CO₂ dans des tissus tels que le rein et le poumon, et participe à la régulation du pH dans des microenvironnements façonnés par le métabolisme et la perfusion. L’activité de CA4 s’articule avec les systèmes de transport du bicarbonate et avec des processus de signalisation sensibles au pH qui influencent la physiologie cellulaire, notamment via la modulation de la fonction des transporteurs et de la capacité tampon extracellulaire. Une activité d’anhydrase carbonique dérégulée et un contrôle du pH altéré sont pertinents dans des phénotypes associés à des maladies touchant la physiologie rénale et pulmonaire, ainsi que dans des contextes où l’acidification extracellulaire affecte le comportement cellulaire.

CA IV Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CA4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CA IV Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CA4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CA4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CA IV. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CA4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CA IV au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CA IV dans les cellules tumorales présentant une expression de CA4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.