C9orf72 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417630-ACT

C9orf72 kodiert ein zytoplasmatisches Protein, das über Interaktionen mit Rab-GTPasen und Regulatoren der Immun-Signalübertragung an endosomalem Transport, der Regulation der Autophagie und der Homöostase lysosomenbezogener Prozesse beteiligt ist. Es wird im Nervensystem und in myeloiden Zelllinien breit exprimiert und beeinflusst dort Vesikeldynamik, Proteostase und den inflammatorischen Grundtonus. Eine Fehlregulation von C9orf72 ist eng mit der Biologie neurodegenerativer Erkrankungen verknüpft, insbesondere mit Mechanismen, die repeat-expansionsassoziierte Veränderungen der Transkription, den RNA-Stoffwechsel und proteotoxischen Stress betreffen. Daher wird C9orf72 häufig in Signalwegen untersucht, die die Autophagie-Lysosomen-Funktion, die angeborene Immunität und die Vulnerabilität von Neuronen miteinander verbinden.

C9orf72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen C9orf72-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C9orf72 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des C9orf72-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der C9orf72-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C9orf72-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native C9orf72-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C9orf72-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C9orf72-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem C9orf72-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.