Plasmide CRISPR d'Activation (h) C9: sc-401198-ACT

Le gène humain C9 code le composant 9 du complément, un effecteur terminal de la cascade du complément qui polymérise au sein du complexe d’attaque membranaire (MAC) afin de perforer les membranes cibles et de favoriser des lésions lytiques. La fonction de C9 s’intègre aux signaux de l’immunité innée via l’activation des voies classique, des lectines et alternative, modulant l’inflammation, l’opsonisation et l’élimination des agents pathogènes. Une activité dérégulée de la voie terminale du complément et le dépôt de MAC ont été impliqués dans des dommages tissulaires et une inflammation chronique dans diverses affections immuno-médiées et dégénératives, ce qui soutient l’utilisation de C9 comme nœud mécanistique pour étudier la pathologie induite par le complément. La modulation expérimentale de l’expression de C9 permet d’examiner comment l’activité terminale du complément influence les réponses au stress cellulaire, l’intégrité des barrières et les interactions entre cellules immunitaires et tissus.

C9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de C9 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

C9 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus C9 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription C9, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de C9. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus C9 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de C9 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie C9 dans les cellules tumorales présentant une expression de C9 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.