Plásmido CRISPR de Activación (m) c-Kit: sc-421289-ACT

Mouse Kit codifica c-Kit (CD117), una tirosina quinasa receptora de tipo III que se une al factor de células madre (stem cell factor) para regular el mantenimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas, el desarrollo de melanocitos y la supervivencia de células germinales. Tras la dimerización inducida por el ligando y la autofosforilación, c-Kit activa las vías de señalización PI3K–AKT, RAS–MAPK, JAK–STAT y PLCγ para controlar la proliferación, la migración y la diferenciación. La señalización de KIT desregulada y la expresión alterada de c-Kit se han implicado en una biología aberrante de los mastocitos y en modelos de neoplasias hematológicas, y se estudian ampliamente en biología del desarrollo e inmunología. Como receptor de superficie con rutas descendentes bien definidas, c-Kit constituye un nodo manejable para investigar umbrales de señalización y decisiones de linaje en sistemas murinos.

c-Kit El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Kit sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

c-Kit El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Kit en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Kit, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de c-Kit. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Kit y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de c-Kit en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía c-Kit en células tumorales con expresión de Kit silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.