Plasmide CRISPR d'Activation (h) BRDT: sc-416531-ACT

BRDT (bromodomain testis-associated) est un lecteur de chromatine de la famille BET qui reconnaît les lysines acétylées sur les queues d’histones afin de réguler les programmes transcriptionnels au cours de la spermatogenèse et de la différenciation des cellules germinales. En modulant l’accessibilité de la chromatine, BRDT influence l’expression génique dépendante de l’ARN polymérase II, le remodelage de la chromatine et le contrôle épigénétique des voies liées à la méiose. Une régulation aberrante des protéines BET, dont BRDT, a été associée à des états transcriptionnels altérés pertinents pour la biologie du cancer, où l’activité des enhancers dépendante des bromodomaines et les programmes de lignée peuvent devenir dérégulés. En tant que facteur enrichi dans le testicule et doté d’interactions médiées par des bromodomaines bien définies, BRDT constitue un modèle utile pour étudier la régulation transcriptionnelle dépendante de l’acétylation et la dynamique de la chromatine.

BRDT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BRDT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BRDT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BRDT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BRDT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BRDT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BRDT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BRDT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BRDT dans les cellules tumorales présentant une expression de BRDT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.