Plasmide CRISPR d'Activation (h) BARD1: sc-401212-ACT

BARD1 (BRCA1 associated RING domain 1) code une protéine nucléaire qui s’hétérodimérise avec BRCA1 pour former un complexe ligase E3 de l’ubiquitine, central pour le maintien de l’intégrité du génome. Ce complexe coordonne la signalisation et la réparation des cassures double brin de l’ADN, soutient la stabilité des fourches de réplication et contribue au contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire via une régulation, dépendante de l’ubiquitine, de substrats associés à la chromatine. BARD1 participe également à la régulation transcriptionnelle et à des processus liés à l’apoptose, reliant les réponses aux dommages de l’ADN à des voies plus larges de stress cellulaire. Une expression ou une fonction altérée de BARD1 a été associée à une recombinaison homologue défectueuse, à une instabilité chromosomique et à des phénotypes de susceptibilité au cancer, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques des réseaux de suppresseurs de tumeurs.

BARD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BARD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BARD1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BARD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BARD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BARD1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BARD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BARD1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BARD1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BARD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.