BARD1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401212-ACT

BARD1 (domínio RING 1 associado ao BRCA1) codifica uma proteína nuclear que forma um heterodímero com o BRCA1 para constituir um complexo de ligase E3 de ubiquitina, central para a manutenção do genoma. Esse complexo coordena a sinalização e o reparo de quebras de dupla fita no DNA, sustenta a estabilidade da forquilha de replicação e contribui para o controle dos checkpoints do ciclo celular por meio da regulação, dependente de ubiquitina, de substratos associados à cromatina. O BARD1 também participa da regulação transcricional e de processos relacionados à apoptose, conectando as respostas a danos no DNA a vias mais amplas de estresse celular. Alterações na expressão ou na função de BARD1 têm sido associadas a recombinação homóloga defeituosa, instabilidade cromossômica e fenótipos de suscetibilidade ao câncer, tornando-o um alvo relevante para estudos mecanísticos de redes de supressores tumorais.

BARD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BARD1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

BARD1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BARD1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BARD1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de BARD1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BARD1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de BARD1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via BARD1 em células tumorais com expressão de BARD1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.