Plasmide CRISPR d'Activation (h) BAM32: sc-404873-ACT

DAPP1 (BAM32) est une protéine adaptatrice enrichie dans les lignées hématopoïétiques, qui couple la signalisation des phosphoinositides à des voies effectrices en aval dans les cellules immunitaires. En se liant au phosphatidylinositol (3,4)-bisphosphate via son domaine d’homologie à la pleckstrine (PH), BAM32 favorise la propagation des signaux dépendante de la PI3K à partir de récepteurs tels que le récepteur des cellules B (BCR) et d’autres immunorécepteurs, en influençant les flux calciques, l’activité des MAPK et le remodelage du cytosquelette. Ces fonctions font de DAPP1 un régulateur de l’activation des lymphocytes, des réponses induites par l’antigène et des réseaux de signalisation inflammatoire. Des voies associées à BAM32 dérégulées ont été impliquées dans une signalisation aberrante des cellules immunitaires et sont fréquemment étudiées dans le cadre de travaux sur les dysfonctionnements immunitaires et les mécanismes des maladies hématologiques.

BAM32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DAPP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BAM32 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DAPP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DAPP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BAM32. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DAPP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BAM32 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BAM32 dans les cellules tumorales présentant une expression de DAPP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.