Plasmide CRISPR d'Activation (m) B7-H4: sc-433877-ACT

Vtcn1 code pour la protéine immunorégulatrice B7-H4, un ligand de la famille B7 principalement associé à des signaux inhibiteurs dans les réponses des lymphocytes T et, plus largement, au contrôle de l’activation immunitaire dans les tissus périphériques. L’expression de B7-H4 sur les cellules présentatrices d’antigène ainsi que dans divers compartiments stromaux ou épithéliaux peut moduler la production de cytokines, la prolifération des lymphocytes T et la tolérance immunitaire, reliant cet axe aux voies qui gouvernent l’immunité adaptative et l’homéostasie inflammatoire. Une dérégulation de B7-H4 a été étudiée dans le contexte de l’échappement immunitaire tumoral, de l’inflammation chronique et de l’immunosuppression associée à l’auto-immunité, ce qui en fait un nœud pertinent pour disséquer une régulation de type « checkpoint » dans des modèles murins. Par ailleurs, la biologie de Vtcn1 est pertinente pour l’étude du dialogue myéloïde–lymphoïde et de l’immunomodulation induite par le microenvironnement tissulaire.

B7-H4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Vtcn1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

B7-H4 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Vtcn1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Vtcn1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de B7-H4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Vtcn1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de B7-H4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie B7-H4 dans les cellules tumorales présentant une expression de Vtcn1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.