Plasmide CRISPR d'Activation (h) ATP5B: sc-401009-ACT

ATP5B code la sous-unité bêta de l’ATP synthase mitochondriale (complexe V), un composant catalytique central du secteur F1, qui couple la force proton-motrice à la production d’ATP lors de la phosphorylation oxydative. En soutenant la bioénergétique cellulaire et le maintien du potentiel de membrane mitochondrial, ATP5B influence des processus tels que l’homéostasie des espèces réactives de l’oxygène, la sensibilité à l’apoptose et l’adaptation métabolique. Des altérations de l’expression ou de la fonction des sous-unités de l’ATP synthase, dont ATP5B, ont été associées à des phénotypes de dysfonction mitochondriale observés dans la neurodégénérescence, le stress cardiométabolique et la reprogrammation métabolique liée au cancer, ce qui en fait un marqueur fréquemment utilisé dans les études de biologie mitochondriale. ATP5B est donc souvent étudié dans des voies reliant l’activité de la chaîne de transport d’électrons à la demande en ATP, au contrôle qualité mitochondrial et à la signalisation des réponses au stress.

ATP5B Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP5B sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ATP5B Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP5B dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP5B, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ATP5B. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP5B natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ATP5B au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ATP5B dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP5B silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.