Plasmide CRISPR d'Activation (m) ASPP1: sc-423473-ACT

Le gène murin Ppp1r13b code ASPP1, un régulateur conservé de la famille p53 qui renforce des programmes transcriptionnels spécifiques de séquence contrôlant l’apoptose, l’arrêt du cycle cellulaire et les réponses aux dommages de l’ADN. ASPP1 module l’équilibre entre les signaux pro-survie et pro-mort en influençant la sélection des gènes cibles de p53, p63 et p73, et coopère avec des voies sensibles au stress qui façonnent l’homéostasie et la différenciation épithéliales. Par ces fonctions, une activité altérée d’ASPP1 est pertinente dans des modèles expérimentaux de suppression tumorale, d’instabilité génomique et de remodelage dépendant du contexte des décisions de destin cellulaire. Ppp1r13b constitue donc un nœud utile pour disséquer les mécanismes de contrôle transcriptionnel qui couplent la détection du stress cellulaire à la mort cellulaire programmée.

ASPP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ppp1r13b sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ASPP1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ppp1r13b dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ppp1r13b, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ASPP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ppp1r13b natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ASPP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ASPP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Ppp1r13b silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.