Plasmide CRISPR d'Activation (h) Arrestin-C: sc-403284-ACT

ARR3 code l’arrestine C, une arrestine enrichie dans les photorécepteurs à cônes, qui se lie aux opsines phosphorylées activées par la lumière afin d’arrêter la signalisation des protéines G et de favoriser la désensibilisation des récepteurs au sein de la cascade de phototransduction. En régulant l’inactivation des GPCR et le trafic des récepteurs, l’arrestine C contribue à façonner l’amplitude du signal et la cinétique de récupération dans les cônes rétiniens, et soutient l’adaptation visuelle. Une dérégulation de la signalisation des GPCR des cônes et de l’extinction médiée par les arrestines a été associée à un dysfonctionnement rétinien, ce qui fait d’ARR3 un point d’entrée moléculaire utile pour étudier les interactions entre GPCR et arrestines ainsi que le contrôle, spécifique des cônes, de la signalisation. ARR3 constitue également un modèle commode pour disséquer les processus dépendants des arrestines dans la biologie des cils/segments externes et dans la signalisation des neurones sensoriels.

Arrestin-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ARR3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Arrestin-C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ARR3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ARR3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Arrestin-C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ARR3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Arrestin-C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Arrestin-C dans les cellules tumorales présentant une expression de ARR3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.