ARFGAP1/3 Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h): sc-406509

Descripción general

ARFGAP3 codifica una proteína activadora de GTPasa del factor de ADP-ribosilación (ARF-GAP) estrechamente relacionada con ARFGAP1, que actúa como regulador del tráfico de membranas dependiente de ARF. ARFGAP1/3 contribuye a la gemación de vesículas y a la dinámica de las cubiertas en las interfaces del Golgi y de los endosomas al promover la hidrólisis de GTP en pequeñas GTPasas de la familia ARF, influyendo así en la clasificación de la carga y en la homeostasis de la vía secretora. A través de estas funciones, ARFGAP1/3 se integra con vías que regulan el reciclaje de receptores, la señalización lipídica y la coordinación del citoesqueleto, que en conjunto determinan la polaridad y la migración celular. La desregulación del tráfico mediado por ARF–GAP se ha relacionado con alteraciones en las salidas de señalización y en respuestas de estrés celular relevantes en contextos de investigación en biología del cáncer y neurobiología.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO ARFGAP1/3 (h) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen ARFGAP3 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus ARFGAP3, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR ARFGAP1/3 (h) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido ARFGAP3.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido ARFGAP1/3 CRISPR/Cas9 KO (h):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto ARFGAP3.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus ARFGAP3 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones ARFGAP3 críticos para la función ARFGAP1/3
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.