ARALAR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403673-ACT

SLC25A12 codifica ARALAR, un trasportatore mitocondriale aspartato–glutammato regolato dal calcio (AGC1) che sostiene la navetta malato–aspartato e accoppia l’equilibrio redox tra citosol e mitocondri. Scambiando aspartato e glutammato attraverso la membrana mitocondriale interna, ARALAR contribuisce a mantenere il trasferimento di NADH, l’anaplerosi del ciclo di Krebs (TCA) e i flussi biosintetici legati al metabolismo energetico neuronale e a vie associate alla mielina. La sua attività integra la funzione mitocondriale con la segnalazione del calcio e il metabolismo degli amminoacidi, influenzando le risposte cellulari allo stress energetico. Alterazioni dell’espressione o della funzione di SLC25A12 sono state associate a fenotipi di tipo neurosviluppo e neurometabolico e vengono studiate in contesti che coinvolgono disfunzione mitocondriale e gestione dei neurotrasmettitori eccitatori.

ARALAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC25A12 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ARALAR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC25A12 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC25A12, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ARALAR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC25A12 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ARALAR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ARALAR nelle cellule tumorali con espressione di SLC25A12 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.