Plasmide CRISPR d'Activation (h) ARALAR: sc-403673-ACT

SLC25A12 code ARALAR, un transporteur mitochondrial aspartate–glutamate (AGC1) régulé par le calcium, qui soutient la navette malate–aspartate et couple l’équilibre rédox du cytosol et des mitochondries. En échangeant l’aspartate et le glutamate à travers la membrane mitochondriale interne, ARALAR contribue au maintien du transfert de NADH, de l’anaplérose du cycle de Krebs (TCA) et de flux biosynthétiques liés au métabolisme énergétique neuronal et aux voies associées à la myéline. Son activité intègre la fonction mitochondriale à la signalisation calcique et au métabolisme des acides aminés, influençant les réponses cellulaires au stress énergétique. Des altérations de l’expression ou de la fonction de SLC25A12 ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurométaboliques, et la protéine est étudiée dans des contextes impliquant un dysfonctionnement mitochondrial et la gestion des neurotransmetteurs excitateurs.

ARALAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC25A12 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ARALAR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC25A12 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC25A12, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ARALAR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC25A12 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ARALAR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ARALAR dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC25A12 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.