ALPPL2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401492-ACT

ALPPL2 kodiert die alkalische Phosphatase, plazentaähnlich 2, ein über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) verankertes Ectoenzym, das an der Zelloberfläche exprimiert wird, wo es Phosphat-Monoester hydrolysiert und die Verfügbarkeit extrazellulärer Nukleotide und von Phosphat modulieren kann. Über seine Membranlokalisation und enzymatische Aktivität ist ALPPL2 mit Prozessen wie epithelialer Differenzierung, der Organisation von Membran-Mikrodomänen und der Regulation von Signalumgebungen an der Plasmamembran verknüpft. Eine veränderte Expression plazentaähnlicher alkalischer Phosphatasen wurde in Zusammenhängen zellulärer Transformation und von Änderungen des Linien- bzw. Zellzustands berichtet, was den Einsatz von ALPPL2 als funktionellen Marker in Studien zur Tumorbiologie und Zellidentität unterstützt. Sein im Vergleich zu ubiquitär exprimierten alkalischen Phosphatasen eingeschränktes physiologisches Expressionsmuster macht ALPPL2 relevant für die Untersuchung krebsassoziierter Programme der Antigenexpression sowie phosphataseabhängiger Umgestaltung des extrazellulären Milieus.

ALPPL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALPPL2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALPPL2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALPPL2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALPPL2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALPPL2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALPPL2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALPPL2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALPPL2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALPPL2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.