AKAP 9 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405430-ACT

AKAP9 codifica a proteína de ancoragem da A-quinase 9 (AKAP9), uma grande proteína de suporte (scaffold) que organiza espacialmente a PKA e outras enzimas de sinalização em compartimentos subcelulares específicos. Localiza-se nos centrossomos e no aparelho de Golgi, onde dá suporte à nucleação de microtúbulos, à montagem do fuso mitótico e à manutenção da polaridade celular, influenciando assim a progressão do ciclo celular e o tráfego intracelular. Ao ancorar a sinalização de AMPc/PKA e coordenar complexos proteicos envolvidos na dinâmica do citoesqueleto, a AKAP9 contribui para eventos regulados de fosforilação durante a mitose e a migração. Alterações na expressão de AKAP9 ou variações estruturais foram associadas à desregulação de sinais proliferativos e à instabilidade cromossômica na biologia do câncer, e também têm sido estudadas no contexto de fenótipos do neurodesenvolvimento e cardíacos.

AKAP 9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AKAP9 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AKAP 9 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AKAP9 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AKAP9, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AKAP 9. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AKAP9 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AKAP 9 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AKAP 9 em células tumorais com expressão de AKAP9 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.