Plasmide CRISPR d'Activation (h) AHNAK: sc-402364-ACT

AHNAK code une protéine d’échafaudage géante qui se localise à la membrane plasmique et dans les compartiments du cytosquelette, où elle contribue à organiser des complexes multiprotéiques impliqués dans l’architecture cellulaire et la transduction des signaux. AHNAK a été associée à la régulation de la dynamique de l’actine, à la réparation membranaire et à des processus dépendants du calcium via des interactions avec les annexines, les protéines S100 et des composants des réseaux jonctionnels et contractiles. En coordonnant le remodelage du cytosquelette et la communication cellule–cellule/cellule–matrice, AHNAK influence la migration, l’adhésion et les réponses au stress. Une expression dérégulée d’AHNAK a été rapportée dans de multiples contextes pathologiques, notamment en cancérologie et lors du remodelage tissulaire, ce qui en fait un nœud d’intérêt pour étudier les voies reliant l’échafaudage membranaire à des programmes transcriptionnels et phénotypiques.

AHNAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AHNAK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AHNAK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AHNAK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AHNAK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AHNAK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AHNAK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AHNAK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AHNAK dans les cellules tumorales présentant une expression de AHNAK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.