Plasmide CRISPR d'Activation (h2) AGPS: sc-404604-ACT-2

Le gène humain AGPS (alkylglycerone phosphate synthase) code une enzyme peroxysomale qui catalyse une étape déterminante de la biosynthèse des phospholipides éther (plasmalogènes) en convertissant l’acyl-dihydroxyacétone phosphate en alkyl-dihydroxyacétone phosphate, contribuant ainsi à la composition membranaire et à la signalisation médiée par les lipides. L’activité d’AGPS relie le métabolisme lipidique dépendant des peroxysomes à des voies plus larges régulant les réponses au stress oxydatif, l’homéostasie des organites et le remodelage lipidique aux interfaces avec le réticulum endoplasmique et les mitochondries. Une altération de la fonction d’AGPS est impliquée dans des troubles de la biogenèse des peroxysomes et de déficit en plasmalogènes, notamment dans les phénotypes du spectre de la chondrodysplasie ponctuée rhizomélique, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des mécanismes de pathologies neurodéveloppementales et squelettiques. L’édition génétique ou la perturbation d’AGPS est utile pour générer des modèles cellulaires permettant d’examiner le flux lipidique peroxysomal, la dynamique membranaire dépendante des plasmalogènes et les effets en aval sur la physiologie et le métabolisme cellulaires.

AGPS Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AGPS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AGPS Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AGPS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AGPS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AGPS. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AGPS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AGPS au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AGPS dans les cellules tumorales présentant une expression de AGPS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.