Plasmide CRISPR d'Activation (h) Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3: sc-400407-ACT

L’ADCY3 humain code l’adénylate cyclase 3 (AC3), une enzyme associée à la membrane qui convertit l’ATP en AMPc en aval de la signalisation des GPCR. En modulant les voies de signalisation dépendantes de l’AMPc/PKA et d’EPAC, AC3 influence les programmes transcriptionnels, l’activité des canaux ioniques et le métabolisme cellulaire, avec des rôles marqués dans les voies chimiosensorielles et la signalisation neuronale. Des altérations de l’expression ou de la fonction d’ADCY3 ont été associées à des phénotypes métaboliques, notamment des traits liés à l’obésité et une dérégulation de l’homéostasie énergétique ; le gène est également étudié dans des contextes où la signalisation par l’AMPc intervient dans l’inflammation et la régulation endocrinienne. En tant que régulateur nodal de la dynamique des seconds messagers, ADCY3 constitue une cible utile pour explorer les réponses de l’AMPc dépendantes du stimulus et les interactions entre voies de signalisation.

Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADCY3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADCY3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADCY3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADCY3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Adenylate cyclase 3/AC3/ADCY3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ADCY3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.