Adenosine A1-R Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401241-ACT

ADORA1 codifica o receptor humano de adenosina A1 (Adenosine A1-R), um GPCR acoplado a Gi/o que detecta a adenosina extracelular e, de modo geral, atenua a excitabilidade celular ao inibir a adenilil ciclase, reduzir a sinalização de cAMP/PKA e modular a condutância de canais iônicos. Por meio do acoplamento a vias ligadas a MAPK e PI3K e da regulação da liberação de neurotransmissores, da condução cardíaca e da hemodinâmica renal, o A1-R integra sinais de estresse metabólico com respostas específicas de cada tecido. Alterações na atividade de ADORA1 e no tônus de adenosina têm sido investigadas em contextos como excitabilidade neurológica, fisiologia cardiovascular, inflamação e sinalização de hipóxia associada a tumores, sustentando seu uso como um nó mecanístico em pesquisas focadas em vias.

Adenosine A1-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADORA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Adenosine A1-R O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADORA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADORA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Adenosine A1-R. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADORA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Adenosine A1-R no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Adenosine A1-R em células tumorais com expressão de ADORA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.