Plasmide CRISPR d'Activation (h) ADAM10: sc-400883-ACT

ADAM10 code une métalloprotéase ancrée à la membrane de la famille ADAM (« a disintegrin and metalloprotease ») qui agit comme une α‑sécrétase majeure responsable du clivage (shedding) de l’ectodomaine de nombreuses protéines de surface cellulaire. En traitant des substrats tels que les récepteurs/ligands NOTCH, les cadhérines, les récepteurs de cytokines et la protéine précurseur de l’amyloïde, ADAM10 influence les décisions de destinée cellulaire, l’adhésion, la migration et la signalisation inflammatoire dans de multiples tissus. La protéolyse médiée par ADAM10 module la dynamique de la signalisation Notch et la disponibilité des récepteurs membranaires, façonnant les programmes transcriptionnels en aval et la communication intercellulaire. Une activité d’ADAM10 dérégulée a été associée à un remodelage pathologique des réseaux de signalisation impliqués dans la neurodégénérescence, la biologie du cancer et la dysrégulation immunitaire, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques du contrôle des voies dépendant des protéases.

ADAM10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADAM10 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ADAM10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADAM10 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADAM10, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ADAM10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADAM10 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ADAM10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ADAM10 dans les cellules tumorales présentant une expression de ADAM10 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.