Plasmide CRISPR d'Activation (h) ACOT8: sc-407262-ACT

L’ACOT8 humain code une thioestérase peroxysomale des acyl‑coenzyme A qui hydrolyse les esters d’acyl‑CoA en acides gras libres et en CoA, contribuant ainsi à équilibrer les pools d’acyl‑CoA et à maintenir la disponibilité en CoA. En régulant la gestion des lipides au niveau des peroxysomes, ACOT8 influence la β‑oxydation des acides gras, le remodelage lipidique et l’homéostasie rédox liée au métabolisme peroxysomal producteur de peroxyde d’hydrogène. L’activité d’ACOT8 s’inscrit également dans des programmes métaboliques plus larges qui coordonnent le dialogue peroxysome–mitochondrie et les réponses cellulaires aux stress nutritionnel et oxydatif. Les altérations du métabolisme lipidique peroxysomal et de l’homéostasie du CoA sont pertinentes pour la dysfonction métabolique et la biologie des maladies associées aux peroxysomes, ce qui soutient l’utilisation d’ACOT8 comme cible dans l’étude de phénotypes cellulaires induits par les lipides.

ACOT8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACOT8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ACOT8 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACOT8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACOT8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ACOT8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACOT8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ACOT8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ACOT8 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACOT8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.