Plasmide CRISPR d'Activation (h) γ1 Tubulin: sc-400327-ACT

TUBG1 code la tubuline γ1 humaine, un composant central du complexe en anneau de la γ‑tubuline, qui initie la nucléation des microtubules aux centrosomes et dans d’autres centres organisateurs des microtubules. En soutenant l’assemblage du fuseau mitotique, l’intégrité du centrosome et la progression du cycle cellulaire, la tubuline γ1 contribue à coordonner la ségrégation des chromosomes et une division cellulaire fidèle. La dynamique des microtubules dépendante de TUBG1 recoupe des voies qui régulent l’organisation du cytosquelette, le trafic intracellulaire et des processus neurodéveloppementaux nécessitant une fonction centrosomale précise. La dérégulation de la nucléation des microtubules et de la mécanique du fuseau est pertinente pour l’instabilité génomique et les phénotypes prolifératifs, faisant de TUBG1 un nœud utile pour étudier la biologie des maladies liées à la division cellulaire.

γ1 Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUBG1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γ1 Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUBG1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUBG1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γ1 Tubulin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUBG1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γ1 Tubulin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γ1 Tubulin dans les cellules tumorales présentant une expression de TUBG1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.