Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-glucuronidase: sc-404187-ACT

GUSB code la β‑glucuronidase humaine, une hydrolase lysosomale qui clive les résidus d’acide β‑D‑glucuronique des glycosaminoglycanes et d’autres substrats contenant des glucuronides lors du renouvellement des macromolécules. En soutenant le catabolisme lysosomal et le recyclage lié à l’autophagie, la β‑glucuronidase contribue à l’homéostasie cellulaire et influence des voies associées au remodelage de la matrice extracellulaire et au trafic endolysosomal. La perte d’activité de GUSB perturbe la dégradation des glycosaminoglycanes et est associée à la mucopolysaccharidose de type VII (syndrome de Sly), ce qui en fait un gène pertinent pour l’étude de la biologie des maladies de surcharge lysosomale et de la protéostasie. GUSB est également largement utilisé comme enzyme lysosomale de référence dans des essais portant sur la fonction des lysosomes, le trafic des enzymes et les réponses au stress lysosomal.

β-glucuronidase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GUSB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-glucuronidase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GUSB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GUSB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-glucuronidase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GUSB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-glucuronidase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-glucuronidase dans les cellules tumorales présentant une expression de GUSB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.