Plasmide CRISPR d'Activation (h) β6 Tubulin: sc-400062-ACT

TUBB6 code la β6-tubuline humaine, une sous-unité essentielle de l’hétérodimère α/β-tubuline qui polymérise en microtubules pour soutenir l’architecture cellulaire, le transport intracellulaire et la formation du fuseau mitotique. Grâce à l’instabilité dynamique, la β6-tubuline contribue au remodelage du cytosquelette, coordonnant le trafic vésiculaire, le positionnement des organites et la ségrégation des chromosomes. La régulation des microtubules recoupe des voies contrôlant la progression du cycle cellulaire, la polarité et les réponses au stress, et une composition ou une expression altérée de la tubuline peut influencer la dynamique des microtubules. Un comportement dérégulé des microtubules est associé à des phénotypes prolifératifs et neurobiologiques, faisant de TUBB6 un point d’entrée utile pour étudier les mécanismes pathologiques liés au cytosquelette.

β6 Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TUBB6 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β6 Tubulin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TUBB6 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TUBB6, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β6 Tubulin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TUBB6 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β6 Tubulin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β6 Tubulin dans les cellules tumorales présentant une expression de TUBB6 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.