ZNRF1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-431297-ACT

O gene murino **Znrf1** codifica a ZNRF1, uma ligase E3 de ubiquitina do tipo RING que ajuda a regular a renovação de proteínas por meio de sinalização dependente de ubiquitina, moldando a homeostase neuronal e as respostas ao estresse celular. A atividade de ZNRF1 tem sido associada à manutenção de axônios e a programas de degeneração, em parte por modular a estabilidade de substratos-chave em vias relacionadas a lesão e estresse. Por meio do controle da ubiquitinação, ZNRF1 pode influenciar a proteostase, a dinâmica do citoesqueleto e a sinalização de sobrevivência que são centrais na neurobiologia. A desregulação desses processos é relevante em modelos de neurodegeneração e de lesão de nervos periféricos, nos quais alterações na sinalização por ubiquitina e na integridade axonal contribuem para fenótipos associados à doença.

ZNRF1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Znrf1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ZNRF1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Znrf1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Znrf1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ZNRF1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Znrf1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ZNRF1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ZNRF1 em células tumorais com expressão de Znrf1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.