Plásmido CRISPR de Activación (m) ZNRF1: sc-431297-ACT

El gen murino **Znrf1** codifica **ZNRF1**, una ligasa de ubiquitina E3 de tipo RING que ayuda a regular el recambio de proteínas mediante señalización dependiente de ubiquitina, dando forma a la homeostasis neuronal y a las respuestas celulares al estrés. La actividad de ZNRF1 se ha relacionado con el mantenimiento axonal y con programas de degeneración, en parte al modular la estabilidad de sustratos clave en vías asociadas a lesión y estrés. A través del control de la ubiquitinación, ZNRF1 puede influir en la proteostasis, la dinámica del citoesqueleto y la señalización de supervivencia, aspectos centrales de la neurobiología. La desregulación de estos procesos es relevante en modelos de neurodegeneración y de lesión de nervio periférico, donde la señalización por ubiquitina alterada y la integridad axonal contribuyen a fenotipos asociados a la enfermedad.

ZNRF1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Znrf1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ZNRF1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Znrf1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Znrf1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ZNRF1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Znrf1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ZNRF1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ZNRF1 en células tumorales con expresión de Znrf1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.