Plásmido CRISPR de Activación (h) Villin: sc-400587-ACT

VIL1 codifica villina, una proteína que se une a la actina y la corta, enriquecida en las microvellosidades del epitelio intestinal y renal, donde ayuda a establecer y remodelar el borde en cepillo apical. La villina regula la organización del citoesqueleto, la polaridad epitelial y la motilidad celular mediante el control dependiente de Ca²⁺ del agrupamiento (bundling) y el corte (severing) de la actina F, conectando la dinámica de la membrana con programas de diferenciación en epitelios absortivos. Como marcador canónico del linaje de los enterocitos, la expresión alterada de VIL1 se utiliza con frecuencia para seguir cambios en el estado epitelial durante la inflamación, las respuestas a lesiones y la transformación oncogénica. Estas propiedades hacen de la villina un punto de partida útil para estudiar la arquitectura de las microvellosidades, la biología de la barrera y la señalización dependiente del citoesqueleto en modelos epiteliales humanos.

Villin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VIL1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Villin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VIL1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VIL1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Villin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VIL1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Villin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Villin en células tumorales con expresión de VIL1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.