UVRAG Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402956-ACT

UVRAG umano (UV radiation resistance associated gene) codifica un regolatore multifunzionale dell’autofagia e del traffico endolisosomiale che sostiene l’omeostasi cellulare in condizioni di stress. UVRAG interagisce con i complessi PI3K di classe III per promuovere la maturazione degli autofagosomi e la fusione autofagosoma–lisosoma, e contribuisce anche al traffico endocitico e alla dinamica delle vescicole tramite interazioni con i macchinari di tethering e fusione. Oltre alle vie degradative, UVRAG è stato collegato al mantenimento dell’integrità genomica e al coordinamento delle risposte al danno, mettendo in connessione i sistemi vescicolari con i programmi di sopravvivenza cellulare. La disregolazione dei processi associati a UVRAG è frequentemente studiata nel contesto della biologia tumorale, della neurodegenerazione e di modelli di infezione, in cui l’alterazione dell’autofagia e del traffico di membrana può rimodellare metabolismo, infiammazione e proteostasi.

UVRAG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UVRAG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UVRAG Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UVRAG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UVRAG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UVRAG. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UVRAG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UVRAG nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UVRAG nelle cellule tumorali con espressione di UVRAG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.