Plásmido CRISPR de Activación (h) UVRAG: sc-402956-ACT

El UVRAG humano (gen asociado a la resistencia a la radiación UV) codifica un regulador multifuncional de la autofagia y del tráfico endolisosomal que sostiene la homeostasis celular bajo estrés. UVRAG interactúa con complejos de PI3K de clase III para promover la maduración del autofagosoma y la fusión autofagosoma–lisosoma, y también contribuye al tráfico endocítico y a la dinámica vesicular mediante interacciones con la maquinaria de anclaje y fusión. Más allá de las vías degradativas, UVRAG se ha vinculado al mantenimiento de la integridad genómica y a la coordinación de las respuestas al daño, conectando los sistemas vesiculares con programas de supervivencia celular. La desregulación de los procesos asociados a UVRAG se estudia con frecuencia en el contexto de la biología tumoral, la neurodegeneración y modelos de infección, donde la alteración de la autofagia y del tráfico de membranas puede remodelar el metabolismo, la inflamación y la proteostasis.

UVRAG El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de UVRAG sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

UVRAG El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus UVRAG en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional UVRAG, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de UVRAG. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo UVRAG y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de UVRAG en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía UVRAG en células tumorales con expresión de UVRAG silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.