UPII Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402242-ACT

UPK2 codifica l’uroplachina II (UPII), un componente integrale delle placche apicali dell’urotelio che contribuiscono a formare la membrana a unità asimmetriche e a sostenere le proprietà di barriera delle cellule ombrello differenziate. UPII si assembla con altre uroplachine lungo la via secretoria e viene trasportata alla superficie apicale, contribuendo all’organizzazione della membrana, alla polarità epiteliale e alla stabilità meccanica nel tratto urinario. In quanto marcatore a espressione ristretta di linea della differenziazione uroteliale, l’alterazione dell’espressione di UPK2 è ampiamente utilizzata per studiare i cambiamenti nei programmi di maturazione epiteliale e nell’identità cellulare nella biologia della vescica. Pattern deregolati di espressione delle uroplachine sono spesso analizzati nel contesto della patologia uroteliale, inclusi gli stati di differenziazione associati ai tumori e l’alterazione della funzione di barriera.

UPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UPK2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UPII Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UPK2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UPK2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UPII. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UPK2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UPII nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UPII nelle cellule tumorali con espressione di UPK2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.