TTP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400722-ACT

Lo ZFP36 umano codifica tristetraprolina (TTP), una proteina legante l’RNA che riconosce elementi ricchi in AU nella 3′ UTR dei trascritti bersaglio e ne promuove la deadenilazione e la degradazione. Attraverso un controllo post-trascrizionale, TTP limita l’espressione di citochine e di geni a risposta immediata e modella i programmi infiammatori e di risposta allo stress, inclusa la segnalazione guidata da TNF/NF-κB. L’attività di TTP è regolata dinamicamente dalla fosforilazione a valle delle vie MAPK, con effetti sul turnover dell’mRNA, sulla traduzione e sulla dinamica dei granuli ribonucleoproteici. Un’espressione o una funzione deregolata di ZFP36/TTP è stata associata ad attivazione immunitaria aberrante, fenotipi infiammatori cronici e reti citochiniche associate al tumore alterate, rendendolo un nodo utile per studi meccanicistici della biologia delle patologie legate all’infiammazione.

TTP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZFP36 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TTP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZFP36 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZFP36, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TTP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZFP36 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TTP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TTP nelle cellule tumorali con espressione di ZFP36 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.