Plasmide CRISPR d'Activation (m) TRIM8: sc-429995-ACT

Trim8 code TRIM8, une ligase E3 d’ubiquitine de la famille des protéines à motif tripartite (TRIM) qui régule le renouvellement des protéines et l’intensité des signaux de signalisation via des mécanismes dépendants de l’ubiquitine. Dans les cellules de souris, TRIM8 a été impliquée dans la modulation des voies inflammatoires et de réponse au stress, notamment par des interactions avec la signalisation NF-κB et avec des régulateurs des programmes transcriptionnels dépendants de p53, influençant ainsi le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose. En modulant la stabilité et l’activité des composants de ces voies, TRIM8 contribue à un contrôle dépendant du contexte de la signalisation de l’immunité innée et de l’homéostasie cellulaire. Une activité dérégulée de TRIM8 a été associée, dans des modèles expérimentaux, à des réponses immunitaires altérées et à des processus oncogènes, ce qui en fait un nœud utile pour l’étude des voies et l’interrogation des phénotypes.

TRIM8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Trim8 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TRIM8 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Trim8 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Trim8, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TRIM8. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Trim8 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TRIM8 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TRIM8 dans les cellules tumorales présentant une expression de Trim8 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.