TRIM8 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-429995-ACT

Trim8 codifica TRIM8, una ligasi E3 dell’ubiquitina della famiglia dei motivi tripartiti (TRIM) che regola il turnover proteico e l’output di segnalazione tramite meccanismi dipendenti dall’ubiquitina. Nelle cellule murine, TRIM8 è stato implicato nella modulazione delle vie infiammatorie e di risposta allo stress, inclusa l’interazione con la segnalazione di NF-κB e con regolatori di programmi trascrizionali dipendenti da p53, influenzando così il controllo del ciclo cellulare e l’apoptosi. Modellando la stabilità e l’attività dei componenti delle vie di segnalazione, TRIM8 contribuisce a un controllo dipendente dal contesto della segnalazione dell’immunità innata e dell’omeostasi cellulare. Un’attività deregolata di TRIM8 è stata associata, in modelli sperimentali, ad alterazioni delle risposte immunitarie e a processi oncogenici, rendendolo un nodo utile per l’interrogazione di vie di segnalazione e fenotipi.

TRIM8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Trim8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRIM8 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Trim8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Trim8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRIM8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Trim8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRIM8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRIM8 nelle cellule tumorali con espressione di Trim8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.