TRIM35 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405277-ACT

TRIM35 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina della famiglia dei motivi tripartiti (TRIM), coinvolta nella regolazione del turnover proteico e della segnalazione dell’immunità innata. Grazie alla sua architettura RING/B-box/coiled-coil, TRIM35 può influenzare processi dipendenti dall’ubiquitina che modellano le risposte antivirali, la segnalazione da stress e il mantenimento dell’omeostasi cellulare. Un’alterata espressione di TRIM35 o la deregolazione delle vie di ubiquitinazione è stata associata a fenotipi rilevanti per l’infiammazione e la biologia dei tumori, rendendo TRIM35 un nodo utile per studi meccanicistici sulla fedeltà della segnalazione. Nei modelli cellulari umani, TRIM35 viene spesso studiato per il suo contributo al crosstalk tra sorveglianza immunitaria e controllo della crescita.

TRIM35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM35 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRIM35 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM35 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM35, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRIM35. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM35 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRIM35 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRIM35 nelle cellule tumorali con espressione di TRIM35 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.