Plásmido CRISPR de Activación (h) TRIM32: sc-402731-ACT

TRIM32 codifica una ligasa E3 de ubiquitina de la familia TRIM que regula la homeostasis proteica al catalizar la ubiquitinación de sustratos y coordinar su recambio mediante el proteasoma. A través de sus dominios RING, B-box, de hélice enrollada (coiled-coil) y repeticiones NHL, TRIM32 influye en la diferenciación miogénica, la organización del citoesqueleto y la señalización sensible al estrés, con vínculos descritos con vías como NF-κB y el control de calidad relacionado con la autofagia. En biología humana, la alteración de la función de TRIM32 se asocia con fenotipos neuromusculares como la distrofia muscular de cinturas y la miopatía congénita, y la expresión desregulada se ha estudiado en contextos relevantes para el cáncer donde se remodelan la proteostasis y los programas transcripcionales. Estas características convierten a TRIM32 en un nodo útil para analizar la regulación dependiente de ubiquitina, las transiciones de estado en células musculares y las relaciones genotipo–fenotipo en modelos celulares.

TRIM32 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TRIM32 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TRIM32 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TRIM32 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TRIM32, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TRIM32. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TRIM32 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TRIM32 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TRIM32 en células tumorales con expresión de TRIM32 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.