TRIM32 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402731-ACT

TRIM32 codifica una ligasi E3 dell’ubiquitina della famiglia TRIM che regola l’omeostasi proteica catalizzando l’ubiquitinazione dei substrati e coordinandone la degradazione proteasomiale. Attraverso i suoi domini RING, B-box, coiled-coil e le ripetizioni NHL, TRIM32 influenza la differenziazione miogenica, l’organizzazione del citoscheletro e la segnalazione responsiva allo stress, con collegamenti riportati a vie che includono NF-κB e il controllo di qualità correlato all’autofagia. Nella biologia umana, un’alterazione della funzione di TRIM32 è associata a fenotipi neuromuscolari quali la distrofia muscolare dei cingoli e miopatie congenite, e la sua espressione deregolata è stata studiata anche in contesti rilevanti per i tumori, in cui vengono rimodellati la proteostasi e i programmi trascrizionali. Queste caratteristiche rendono TRIM32 un nodo utile per analizzare la regolazione dipendente dall’ubiquitina, le transizioni di stato delle cellule muscolari e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari.

TRIM32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TRIM32 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TRIM32 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TRIM32 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TRIM32, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TRIM32. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TRIM32 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TRIM32 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TRIM32 nelle cellule tumorali con espressione di TRIM32 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.