TRIM14 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-405847-ACT-2

Das humane TRIM14 (tripartite motif-containing 14) kodiert ein zytosolisches Adapterprotein der TRIM-Familie, das an der Regulation der angeborenen Immunantwort beteiligt ist, indem es Signalkomplexe organisiert, die die Induktion von Typ-I-Interferonen sowie entzündliche Transkriptionsprogramme nachgeschaltet an Mustererkennungsrezeptoren (pattern-recognition receptors, PRRs) modulieren. TRIM14 wirkt an antiviralen Abwehrwegen mit, indem es die ubiquitinabhängige Signalweiterleitung sowie die Stabilität oder Aktivität zentraler Mediatoren wie Komponenten der cGAS–STING-, MAVS- und NF-κB-assoziierten Signalachsen beeinflusst und dadurch die Zytokinausschüttung und die Expression interferonstimulierter Gene prägt. Eine Fehlregulation der TRIM14-Signalgebung wurde mit veränderten Wirt–Pathogen-Reaktionen und immunassoziierter Pathophysiologie in Verbindung gebracht, einschließlich chronischer Entzündung und Kontexten, die für die Immunflucht von Tumoren relevant sind. Geneditierung von TRIM14 und funktionell-genomische Werkzeuge unterstützen mechanistische Untersuchungen der PRR-Signalübertragung, der Wechselwirkungen mit Ubiquitin-Signalwegen sowie interferongetriebener transkriptioneller Netzwerke in humanen Zellen.

TRIM14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIM14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRIM14 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIM14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIM14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRIM14-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIM14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRIM14-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRIM14-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIM14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.