Plásmido CRISPR de Activación (h) TMEM192: sc-415021-ACT

El TMEM192 humano codifica una proteína transmembrana asociada a los lisosomas, implicada en la organización endolisosomal y el tráfico vesicular. Su localización en las membranas lisosomales respalda funciones en la integridad del lisosoma, el procesamiento de la carga y la coordinación de las vías de autofagia–lisosoma que mantienen la proteostasis celular. Dado que la función lisosomal influye en la señalización inmunitaria innata, la adaptación metabólica y las respuestas al estrés, la alteración de la actividad de TMEM192 es relevante para la investigación sobre neurodegeneración, supervivencia de células cancerosas y fenotipos inflamatorios en los que los procesos dependientes de lisosomas se ven con frecuencia perturbados. Modificar la expresión de TMEM192 ofrece un enfoque manejable para examinar la regulación centrada en el lisosoma de las vías de degradación y el crosstalk entre rutas de señalización.

TMEM192 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TMEM192 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TMEM192 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TMEM192 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TMEM192, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TMEM192. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TMEM192 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TMEM192 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TMEM192 en células tumorales con expresión de TMEM192 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.