TMEFF1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404818-ACT

A TMEFF1 humana (proteína transmembrana com domínio tipo EGF e dois domínios semelhantes à folistatina 1) codifica uma proteína de membrana de passagem única, implicada em interações com ligantes extracelulares e na modulação da sinalização por fatores de crescimento. Funções descritas relacionam a TMEFF1 à regulação de programas de proliferação e diferenciação celular, com efeitos dependentes do contexto em vias de receptores tirosina-quinase, como a sinalização EGFR/ERK e PI3K–AKT. A expressão de TMEFF1 encontra-se frequentemente desregulada em múltiplos tipos de tumor e tem sido associada a alterações de estados epiteliais, invasividade e sinalização do microambiente. Essas características tornam a TMEFF1 um alvo útil para estudar a integração de sinais na membrana plasmática e as consequências transcricionais de perturbações em vias de fatores de crescimento.

TMEFF1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TMEFF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TMEFF1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TMEFF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TMEFF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TMEFF1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TMEFF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TMEFF1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TMEFF1 em células tumorais com expressão de TMEFF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.