Strumpellin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402808-ACT

O WASHC5 codifica a Strumpellin, uma subunidade essencial do complexo WASH que regula a nucleação de actina dependente de Arp2/3 em endossomos para controlar a remodelação de membranas, a tubulação endossomal e a triagem do carregamento de receptores. Por meio do seu papel na reciclagem de endossomos para a membrana plasmática e no tráfego associado ao retromer, a Strumpellin influencia a disponibilidade de receptores de sinalização, a organização do citoesqueleto e a motilidade celular. A perturbação da dinâmica endossomal dependente de WASHC5 tem sido associada a fenótipos neurodegenerativos, incluindo a paraplegia espástica hereditária, destacando a sua relevância para a manutenção neuronal e a integridade dos axónios. Assim, a função da Strumpellin é de interesse para o estudo da homeostase endolisossomal, da dinâmica de membranas impulsionada por actina e da regulação, dependente do tráfego, de vias de sinalização.

Strumpellin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de WASHC5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Strumpellin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus WASHC5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição WASHC5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Strumpellin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus WASHC5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Strumpellin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Strumpellin em células tumorais com expressão de WASHC5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.