Plásmido CRISPR de Activación (h) spectrin β III: sc-402980-ACT

SPTBN2 codifica la espectrina βIII humana, un andamiaje citosquelético que forma heterotetrámeros con las α-espectrinas para estabilizar las redes corticales de actina y organizar microdominios de membrana. La espectrina βIII ayuda a mantener la forma celular y la resistencia mecánica, a la vez que coordina el tráfico y la localización de canales iónicos, receptores y complejos de señalización, conectando la dinámica del citoesqueleto con procesos como el crecimiento de neuritas y la organización sináptica. En neuronas, SPTBN2 es especialmente relevante para el desarrollo del cerebelo y la función de las células de Purkinje, y su desregulación se asocia con fenotipos de neurodesarrollo y neurodegeneración. Estas propiedades convierten a SPTBN2 en un nodo útil para estudiar la señalización del citoesqueleto, la compartimentación de proteínas de membrana y las respuestas al estrés que dependen de la arquitectura actina–espectrina.

spectrin β III El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SPTBN2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

spectrin β III El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SPTBN2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SPTBN2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de spectrin β III. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SPTBN2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de spectrin β III en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía spectrin β III en células tumorales con expresión de SPTBN2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.