Plásmido CRISPR de Activación (h) Smad5: sc-400443-ACT

SMAD5 codifica Smad5, un SMAD regulado por receptor que transmite las señales de BMP aguas abajo de los receptores serina/treonina cinasa de tipo I/II. Tras su fosforilación, Smad5 forma complejos con SMAD4 y se acumula en el núcleo para regular programas transcripcionales que controlan el patrón embrionario, la diferenciación osteogénica y vascular, y la homeostasis tisular. La señalización BMP/SMAD mediada por SMAD5 se integra con redes de desarrollo y diferenciación y puede modular la expresión génica del ciclo celular y de especificación de linaje según el contexto celular. La desregulación de la señalización BMP–SMAD, incluida la alteración de la actividad de SMAD5, se ha implicado en malformaciones congénitas y se ha investigado en cambios de diferenciación asociados a enfermedad, estados transcripcionales relacionados con la fibrosis y la biología tumoral.

Smad5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SMAD5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Smad5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SMAD5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SMAD5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Smad5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SMAD5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Smad5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Smad5 en células tumorales con expresión de SMAD5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.