SHP CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400964-ACT

Das humane NR0B2-Gen codiert den Small Heterodimer Partner (SHP), einen atypischen verwaisten nukleären Rezeptor, dem eine DNA-Bindedomäne fehlt und der primär als transkriptioneller Korepressor wirkt. SHP moduliert die Signalübertragung nukleärer Rezeptoren durch Interaktion mit Partnern wie LRH-1 (NR5A2), HNF4A, FXR (NR1H4) und PXR (NR1I2) und prägt dadurch die Gallensäurehomöostase, den Lipid- und Glukosestoffwechsel sowie hepato-biliäre Genprogramme. Über die Rückkopplungskontrolle in der FXR–SHP-Achse trägt es dazu bei, die durch CYP7A1 getriebene Gallensäuresynthese zu begrenzen, und beeinflusst mitochondriale sowie entzündungsbezogene Transkriptionsnetzwerke in Stoffwechselgeweben. Eine dysregulierte SHP-Aktivität wurde in Forschungszusammenhängen mit cholestatischen Stressantworten, Phänotypen der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung, Signalwegen der Insulinresistenz und der Biologie hepatozellulärer Tumoren in Verbindung gebracht – vermittelt über eine veränderte transkriptionelle Kontrolle von Proliferation und Apoptose.

SHP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NR0B2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SHP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NR0B2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NR0B2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SHP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NR0B2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SHP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SHP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NR0B2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.