Plasmide CRISPR d'Activation (h) RPGR: sc-404441-ACT

Le RPGR (régulateur de la GTPase associé à la rétinite pigmentaire) humain se localise principalement au cil de connexion des photorécepteurs ainsi qu’au centrosome et à des compartiments associés au corps basal, où il soutient le trafic des protéines ciliaires et le transport dépendant des microtubules. Par ses interactions avec la machinerie ciliaire et le système de transport intraflagellaire, le RPGR contribue au maintien de l’intégrité du segment externe et à l’homéostasie des photorécepteurs. L’altération des processus ciliaires dépendants du RPGR est fortement associée à des phénotypes de dégénérescence rétinienne, notamment la rétinite pigmentaire liée à l’X et d’autres dystrophies rétiniennes héréditaires apparentées, soulignant son importance dans la biologie des cils sensoriels.

RPGR Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPGR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RPGR Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPGR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPGR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RPGR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPGR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RPGR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RPGR dans les cellules tumorales présentant une expression de RPGR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.