Plásmido CRISPR de Activación (h) RFC1: sc-402122-ACT

RFC1 codifica el factor de replicación C, subunidad 1, la subunidad grande del complejo cargador de la abrazadera (clamp loader) RFC, que carga PCNA sobre el ADN para promover la actividad de las ADN polimerasas con alta procesividad. Este proceso dependiente de ATP es fundamental para la replicación del ADN, la maduración de los fragmentos de Okazaki y múltiples vías de reparación del ADN, incluidas la reparación por escisión de nucleótidos, la reparación por escisión de bases y la reparación de apareamientos erróneos (mismatch repair). Debido a su papel en las respuestas al estrés replicativo y en el mantenimiento de la estabilidad del genoma, RFC1 se estudia con frecuencia en el contexto del control del ciclo celular y la señalización del daño al ADN. La actividad desregulada de la vía de RFC1 es relevante en biología proliferativa y en fenotipos de inestabilidad genómica que se modelan comúnmente en cáncer y otros trastornos asociados a la reparación del ADN.

RFC1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RFC1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RFC1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RFC1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RFC1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RFC1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RFC1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RFC1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RFC1 en células tumorales con expresión de RFC1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.