Rent1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402462-ACT

A UPF1 humana (Rent1) é uma helicase de RNA dependente de ATP e o principal efetor da degradação de mRNA mediada por nonsense (NMD), uma via conservada que detecta e degrada transcritos contendo códons de terminação prematuros. Por meio de interações com proteínas SMG e com o complexo de junção de éxons, a UPF1 acopla a vigilância do término da tradução à remodelagem de mRNPs, ao controle de qualidade de RNA e à regulação de isoformas normais de transcritos. Para além da NMD, a UPF1 contribui para a manutenção dos telômeros, a estabilidade genômica e o metabolismo de RNA responsivo ao estresse, conectando a vigilância de RNA a uma homeostase celular mais ampla. A desregulação da atividade de UPF1 tem sido associada a alterações na integridade do transcriptoma e a uma produção proteômica aberrante em contextos que incluem tumorigênese e fenótipos do neurodesenvolvimento, sustentando sua utilidade para estudos mecanísticos de regulação de RNA.

Rent1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UPF1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Rent1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UPF1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UPF1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Rent1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UPF1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Rent1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Rent1 em células tumorais com expressão de UPF1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.