Plásmido CRISPR de Activación (h) RecQL4: sc-403224-ACT

RECQL4 codifica la helicasa de ADN humana RecQ RecQL4, un factor de mantenimiento del genoma necesario para el inicio de la replicación del ADN, la estabilización de horquillas de replicación detenidas y múltiples mecanismos de reparación del ADN, incluida la recombinación homóloga y la reparación por escisión de bases. RecQL4 actúa dentro de la red más amplia de respuesta al daño del ADN para preservar la integridad cromosómica durante la fase S y tras el estrés genotóxico. La actividad desregulada de RECQL4 se asocia con estrés replicativo, inestabilidad cromosómica y sensibilidad alterada a agentes que dañan el ADN, lo que la hace relevante para el estudio de las vías de estabilidad genómica. Las variantes patogénicas en RECQL4 se asocian con trastornos hereditarios que presentan defectos del desarrollo y predisposición al cáncer, lo que respalda su uso en modelos mecanísticos de disfunción de la reparación del ADN asociada a enfermedad.

RecQL4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RECQL4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RecQL4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RECQL4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RECQL4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RecQL4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RECQL4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RecQL4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RecQL4 en células tumorales con expresión de RECQL4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.