PSS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404364-ACT

Das humane PTDSS1 kodiert die Phosphatidylserin-Synthase 1 (PSS1), ein Membranenzyms des endoplasmatischen Retikulums, das die Bildung von Phosphatidylserin über Basenaustauschreaktionen katalysiert, wobei Phosphatidylcholin als Substrat dient. Phosphatidylserin ist ein zentrales anionisches Phospholipid, das die Membranbiogenese, den vesikulären Transport und lipidabhängige Signalübertragung unterstützt, und es liefert Vorläuferfluss in Richtung Phosphatidylethanolamin durch mitochondriale Decarboxylierung. Durch die Prägung von Membranzusammensetzung und -ladung beeinflusst die PSS1-Aktivität Kontaktstellen zwischen Organellen, Stressantworten und Signalwege, die mit der apoptoseassoziierten Externalisierung von Phosphatidylserin verknüpft sind. Eine dysregulierte Phosphatidylserin-Homöostase wurde mit veränderter neuronaler Funktion, skelettalen Phänotypen und membranbezogenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, was PTDSS1 zu einem nützlichen Ansatzpunkt für mechanistische Studien der Lipidhomöostase macht.

PSS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTDSS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PSS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTDSS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTDSS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PSS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTDSS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PSS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PSS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTDSS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.