PREP-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402314-ACT

PKNOX1 codifica il fattore di trascrizione umano TALE homeobox PREP-1, una proteina nucleare legante il DNA che interagisce con cofattori delle famiglie PBX e MEIS per regolare l’attività di enhancer e promotori durante lo sviluppo e le decisioni di destino cellulare. PREP-1 contribuisce a programmi trascrizionali che controllano differenziamento, proliferazione e omeostasi metabolica, e la sua attività si integra con reti geniche più ampie regolate da homeobox. Un’espressione deregolata di PKNOX1/PREP-1 è stata associata ad alterazioni nella specificazione di linea e a stati trascrizionali oncogenici in molteplici contesti, a sostegno del suo impiego come nodo per lo studio del controllo trascrizionale in modelli rilevanti per la malattia. In quanto regolatore associato alla cromatina, PREP-1 è inoltre pertinente alle indagini sull’architettura della regolazione genica e sulla funzione degli enhancer dipendente dal contesto.

PREP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PKNOX1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PREP-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PKNOX1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PKNOX1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PREP-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PKNOX1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PREP-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PREP-1 nelle cellule tumorali con espressione di PKNOX1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.