Positive cofactor 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403272-ACT

O gene humano SUB1 codifica o Cofator Positivo 4 (PC4), um coativador transcricional de ligação ao DNA que modula a transcrição pela RNA polimerase II ao estabilizar complexos de pré-iniciação e coordenar a expressão gênica dependente de ativadores. O PC4 também participa da manutenção do genoma ao influenciar respostas a danos no DNA e a dinâmica da cromatina associada ao reparo, conectando o controle transcricional ao estresse replicativo e a programas celulares de recuperação. Por meio dessas funções, SUB1/PC4 tem sido estudado em vias que regulam a progressão do ciclo celular, a transcrição responsiva ao estresse e o equilíbrio entre transcrição e reparo do DNA. Atividade desregulada de PC4 e padrões alterados de expressão de SUB1 foram relatados em múltiplos contextos relevantes para doenças, sustentando sua utilidade como um nó mecanístico para dissecar a estabilidade do genoma acoplada à transcrição.

Positive cofactor 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SUB1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Positive cofactor 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SUB1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SUB1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Positive cofactor 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SUB1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Positive cofactor 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Positive cofactor 4 em células tumorais com expressão de SUB1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.