Plasmide CRISPR d'Activation (h) PLC β3: sc-401181-ACT

PLCB3 code la phospholipase C bêta 3 (PLCβ3), un effecteur clé en aval des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate pour produire de l’inositol 1,4,5-trisphosphate et du diacylglycérol. Cet axe de signalisation augmente le Ca2+ intracellulaire et active la protéine kinase C, en intégrant des signaux qui régulent la sécrétion, la migration, le remodelage du cytosquelette et des programmes transcriptionnels. L’activité de PLCβ3 relie la signalisation des GPCR au renouvellement des phosphoinositides et aux voies dépendantes du calcium qui façonnent les réponses immunitaires innées et adaptatives, ainsi que des transitions plus larges d’état cellulaire. La dérégulation de la signalisation des phospholipases C a été associée à une prolifération aberrante et à des phénotypes inflammatoires, faisant de PLCB3 un nœud utile pour des études mécanistiques de la transduction du signal et des comportements cellulaires pertinents pour les maladies.

PLC β3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PLCB3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PLC β3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PLCB3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PLCB3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PLC β3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PLCB3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PLC β3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PLC β3 dans les cellules tumorales présentant une expression de PLCB3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.